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• 何瑞修·肯恩（Horatio Caine）：大衛·卡羅素（David Caruso）飾演，是邁阿密達德郡犯罪實驗室的主管，曾經是炸彈拆除小組的警官，現在是鑑識分析師。他致力於保護善良百姓。有時候他的組員會直接叫他「H」。他的註冊商標是戴上與拿下他的太陽眼鏡，每一集都會表演很多次。在前3季裡，何瑞修的背景故事（關於他弟弟的）慢慢地被揭露。在第4季裡，在先前這條故事線結束後，另外一部份關於他的過去也開始被揭露。在編號408的「Nailed」這一集裡，肯恩發現紐約的一個地方檢察官開始調查他與殺母兇手被謀殺這件事之間的關聯。
• 卡莉·杜肯（Calleigh Duquesne）：艾蜜莉·波克特（Emily Procter）飾演，彈道學專家，出生於路易西安那州達尼爾（Darnell），西班牙語十分流利，曾在圖蘭大學（Tulane University）獲得物理學學士學位。在紐奧爾良警察局工作的時候，她有個綽號叫「子彈女孩」。父親是個多次戒酒失敗的酗酒律師，母親據信應該還住在路易西安那。
• 艾瑞克·達可（Eric Delko）：亞當·羅德瑞茲（Adam Rodriguez）飾演，指紋與藥品辨識專家，土生土長於邁阿密，曾在邁阿密大學獲得化學學士學位。父親俄羅斯人，母親古巴人，所以西班牙語和俄語都很流利。當情況需要時，達可在小組裡通常是扮演蛙人的角色。在集數編號410「Shattered」這一集裡，達可被控藏匿毒品因而危害了他的工作。不過後來證實他買這些藥是為了幫助他重病的妹妹減少乳癌的疼痛。
• 艾利絲·伍德醫生（Alexx Woods）：甘蒂·亞歷山大（Khandi Alexander）飾演，邁阿密達德郡的驗屍官。艾利絲的醫生生涯從當一名實習醫師開始，後來她離開紐約來到邁阿密擔任驗屍官。她有一個古怪的習慣就是在驗屍的時候跟屍體講話，通常是想要讓死者死後可以更為安詳。已婚，育有一子一女。
• 雷恩·沃夫（Ryan Wolfe）：強納森·托哥（Jonathan Togo）飾演，是一個想進入實際鑑識工作的基層巡邏員警。何瑞修僱用他以遞補已殉職的史畢的位置，因為他不僅有足夠的技術，而且他平時有注意保養他的配槍——史畢就是忽略了這個防備措施才殉職的。他瞭解到自己永遠無法取代史畢的地位，只能盡力地成為小組的一員。沃夫首次出現在「Under the Influence」這一集，不過直到「Hell Night」這一集之後才變成常態演出。在集數編號408的「Nailed」這一集裡，雷恩的右眼眼角被釘槍射中，雖然傷勢不嚴重，不過不知道日後會不會對他的視力造成影響。

配角

• 法蘭克·崔普（Frank Tripp）：雷克斯·林恩（Rex Linn）飾演，重案組探員。前幾季偶爾出現，在第四季變成常態出現的配角。

• 娜塔莉·寶兒·薇絲塔（Natalia Boa Vista）：伊芙·拉茹（Eva LaRue）飾演，第4季才出現的新面孔，新來的拉丁美洲裔DNA分析員，由於她的聯邦僱約的限制，所以只能處理非熱門案件或是懸案。

離開的主角

• 梅根·唐那（Megan Donner）：金·迪蘭妮（Kim Delaney）飾演，出現在第1季前10集。曾經擔任何瑞修現在的職位，在哀悼完喪夫之痛後回到工作崗位之後降級成為一個調查員，但是之後還是因為受不了喪夫之痛所造成的壓力而離職。她的角色在第1季第10集之後離開的原因，主要是因為她和卡羅素之間合作默契不夠，缺少共同語言。
• 提姆·（史畢）史畢鐸（Tim "Speed" Speedle）：羅瑞·寇克蘭（Rory Cochrane）飾演，出現在前兩季。證據追蹤與壓痕專家，出生於紐約州西拉鳩斯市（Syracuse），曾在哥倫比亞大學獲得生物學學位。史畢在第3季第1集「Lost Son」一開始就在任務中陣亡，劇中他的武器在槍戰時故障。他的角色離開的原因是因為本人的請求。寇克蘭希望可以發展他的電影事業，而且他不是很喜歡影集冗長的拍攝行程。
• 椰莉娜·沙拉斯（Yelina Salas）：蘇菲亞·米洛斯（Sofia Milos）飾演，出現在第2、3季。一個常常跟CSI一起調查的重案組探員，也是何瑞修弟弟雷蒙的遺孀。她後來與內務部的警官瑞克·史特勒（Rick Stetler），何瑞修的死對頭，交往。在第3季最後發現她的丈夫雷蒙其實並沒有死，為了確保他的安全，她帶著兒子與他一起前往巴西躲藏。

 其他配角

• 泰勒·簡森（Tyler Jensen）：布萊恩·波斯（BrianPoth）飾演，實驗室技師，專長是多媒體分析。
• 瑞克·史特勒（Rick Stetler）：大衛·李·史密斯（David Lee Smith）飾演，第2季開始出現，內務部警官，何瑞修的死對頭。後來他與椰莉娜交往，不過她在第3季結尾時與她丈夫一起離開。他對肯恩相當不友善，據信是因為後者取代他晉陞為組長的挫敗感使然。他認為肯恩一定是搞了一些「小動作」才獲得這個職位的。
• 麥欣·薇樂拉（Maxine Valera）：波提·安·布莉絲（Boti Ann Bliss）飾演，DNA分析師，第2季開始出現，在第3季因為犯錯而被解僱，不過第4季再度出現。
• 彼得·艾略特（Peter Elliott）：麥克·西爾弗（Michael B. Silver）飾演，第2季開始出現，美國特勤局經濟犯罪部門的探員。
• 約瑟夫·凱爾（Joseph Kayle）：小萊斯裡·歐多姆（Leslie Odom Jr.）飾演，第2季開始出現，實驗室技師。
• 亞倫·彼得斯（Aaron Peters）：亞曼多·維得-甘迺迪（Armando Valdes-Kennedy）飾演，第3季開始出現，實驗室技師。
• 丹·庫柏（Dan Cooper）：布蘭登·費爾（Brendan Fehr）飾演，第4季開始出現，新來的影音分析師。

離開的配角

• 約翰·哈根（John Hagen）：霍特·麥考蘭尼（Holt McCallany）飾演，第1至3季中出現，重案組探員，有情緒與心理方面的問題。他與卡莉在第2季曾經交往一段短暫的時間。在第3季結尾的時候，他在彈道實驗室舉槍自殺，當時卡莉也在場。
• 艾得莉·莎薇拉（Adelle Sevilla）：汪達·狄耶穌（Wanda de Jesus）飾演，第1季中出現，拉丁美洲裔的重案組探員，常常跟CSI小組一起出任務。她大約演出了10集。

• 麥克·泰勒（Mac Taylor）：蓋瑞·辛尼斯（Gary Sinise）飾演，是CSI團隊的領導人，常被叫做Mac，妻子死於911事件。他總是睡得不好，但是堅信證據的重要性。曾經加入美軍陸戰隊服役；他也曾經說過在這世界上最想做的事就是為國家服務。他與波納席拉探員之間有著親密的友誼關係。他是一名貝絲樂手，在一間爵士俱樂部中定期表演。在第三季中，他與新加入的驗屍官Dr. Peyton Driscoll有著感情的發展。
• 史黛拉·波納席拉（Stella Bonasera）探員：美琳娜·卡娜卡瑞迪斯（Melina Kanakaredes）飾演，把自己完全奉獻給工作。她常常被叫做「自由女神」，因為她強硬的個性、強烈的決心、以及高度的智慧使然。她是一半希臘、一半義大利血統的孤兒，從小在寄養家庭中長大。她跟麥克是非常好的朋友，總是擔心他的生理與心理的狀態。她在第二季「全面通行」中，被精神狀態不穩的男友禁錮於她的家中，並且嘗試殺害她。最後史黛拉被迫因自衛而開槍殺死男友，但她卻受了很大的精神傷害。在第三季的「Heart of Glass」中，她被兇案現場的染血玻璃割傷，及後發現死者是愛滋病患者，她也有可能會被感染。
• 丹尼·麥瑟（Danny Messer）探員：卡明·喬文納佐（Carmine Giovinazzo）飾演，這個角色被認為是影集裡最複雜的一個。他在史坦頓島的一個「義大利黑手黨」家庭中被監視著長大（參見「Tanglewood」這一集），有著一套自己的混合道德觀（介於違法者與執法者之間）。麥克親自挑選丹尼加入這個團隊，這對後者來說是項榮譽與責任，每天都為他帶來不少壓力。他生性多疑，不容易相信他人。佛列克探員是他的好友，可以說是他唯一願意交附信任的人。丹尼被捲入第二季「法網恢恢」中，一宗十五年前的兇殺案。他的哥哥路易為得到真正兇手的證言，被痛打至昏迷，但成功地證明了丹尼的清白。丹尼對新加入的組員琳賽極有好感，卻被琳賽在「Love Run Cold」中拒絕了進一步的發展，但琳賽同時承認了自己對丹尼也存有好感。在「Sleight out of Hand」中，他去了蒙大拿旁聽琳賽出庭作證，並且於案件裁決後與琳賽牽手離去。
• 薛爾登·霍克（Sheldon Hawkes）醫檢員：希爾·哈潑（Hill Harper）飾演，天才兒童，才18歲就從大學畢業；24歲獲得外科醫師執業執照。然而，因無法救回兩個病人，從此放棄成為一個外科醫生，成為一個醫檢員。在第2季裡，霍克離開解剖室，改而從事現場調查工作。在「Raising Shane」，他在一單兇殺中成為主要疑犯，而整個團隊也被要求移交此案件。但最後還是其他團員發現線索，證明了霍克的清白。
• 唐·佛列克（Don Flack）探員：艾迪·卡希爾（Eddie Cahill）飾演，來自一個世代從事執法工作的家族。他是紐約警局舊式辦案風格與新時代的CSI之間的橋樑。他是個風趣的重案組探員，但是對嫌犯缺乏耐心。他的辦案技巧常常接近法律容許的邊界，不過總是蠻有效果的。他與丹尼·麥瑟是好友，總是願意傾聽後者的問題（參見「On the Job」這一集）。在第二季的最後一集「炸彈客」中，他被兇殺案現場的炸彈嚴重地炸傷，並且到完結時仍然昏迷不醒。在第三季開始時他完全康復，並回到工作崗位。
• 琳賽·夢露（Lindsay Monroe）：安娜·貝爾納普（Anna Belknap）飾演，鑑識科學家，在艾婷·波恩被解僱之後從蒙大拿州調過來。首次出現是在「Zoo York」這一集。來自中西部的琳賽是一名性格爽朗的女孩子，身手矯健，加入不久就完全融入了原來的團隊。丹尼不時表現出對琳賽的興趣；第三季「Love Run Cold」中，當丹尼向琳賽表示他對她有好感時，琳賽承認自己對丹尼也有好感，但因為個人的問題而不希望有進一步的發展。隨後在「Silent Night」中，她在剛到達兇殺現場後就立即離開，神情激動。及後她向史黛拉說出自己曾經是一件兇殺案中唯一的悻存者，而被害者當中有她的朋友。在「Lying Game」中，她被要求回到蒙大拿為這件兇殺出庭作證，因而短暫地離開了團隊。

• 吉爾伯特·亞瑟·葛瑞森（Gilbert Arthur Grissom）：拉斯維加斯CSI部門的夜班主管，也是一位鑑識昆蟲學家，曾在加州大學洛杉磯分校（UCLA）獲得生物學學位。有個綽號叫「昆蟲人」。葛瑞森通曉手語，也遺傳了他媽媽的耳硬化疾病（otosclerosis），這個疾病讓他逐漸耳聾，這件事也發展成第三季主要的劇情線之一。在第三季和第四季之間他進行了治療耳硬化癥狀所需的手術（以及之後的恢復療程），不過這段劇情只是一筆帶過並沒有播出。他的嗜好包括他的工作、賽蟑螂、閱讀古典文學（包括拼字遊戲）、與雲霄飛車。他的團隊是由四個主要的CSI幹員所組成，加上一組技術人員從旁協助。在前四季里，他的團隊成員有：凱薩琳·韋羅斯、尼克·史多克斯、華瑞克·布朗、和莎拉·賽德爾。在第五季中期因為副局長康瑞德·艾克利（Conrad Ecklie）調查因證據出現瑕疵，使葛瑞森被迫重開調查的刑案，將原始夜班所有人馬拆散後，他的團隊現在由莎拉·賽德爾、葛瑞格·山德斯、以及蘇菲亞·寇蒂絲（Sofia Curtis）所組成，而在第五季最後尼克史多克斯身陷葬身危機（Grave Danger）後，向艾克利要求他的人馬全部回到夜班，第六季後所有主角便回到夜班出勤，而蘇菲亞則調職為警探，首先在其他地方服勤，後來調回拉斯維加斯警局刑案組繼續和CSI合作。
• 凱薩琳·韋羅斯（Catherine Willows）：在前四季是夜班的副主管，當葛瑞森出城或是因為其他理由休假時，由她來代理主管職務。第五季開始，她向行政單位申請升遷為日班組長，並請葛瑞森推薦，中期她奉命調到新成立的午班擔任主管，尼克·史多克斯與華瑞克·布朗也調至午班協助。第六季後則回到夜班重作葛瑞森副手。韋羅斯是一個血液飛濺分析師，出生於蒙大拿州波茲曼市（Bozeman）。為了支付在內華達州立大學拉斯維加斯分校（UNLV）修習醫工學程的學費，曾經當過脫衣舞者。有一個小女兒，名叫琳茜（Lindsey）。很不幸的是，在前夫慘遭謀殺後，她無法找到足以將殺人兇手定罪的證據。在第三季最後一集「失控」（Inside the Box），凱薩琳發現她的生父是聲名狼藉的賭場所有人以及謀殺嫌疑犯山姆·布朗（Sam Braun）。
• 華瑞克·布朗（Warrick Brown）：土生土長的拉斯維加斯人，在內華達州立大學拉斯維加斯分校（UNLV）主修化學，是一位語音與影像分析師。在第一季（尤其是首集）有一個主題就是以他的賭癮及之後他的戒賭過程為主。他是葛瑞森夜班團隊的一員，不過在第五季中期轉到了韋羅斯的午班團隊。因為見到同伴尼克在第五季最後兩集的事件，感嘆世事無常，便與交往不久，在醫院擔任醫生的新女友蒂娜（Tina）閃電結婚，在第六季回到葛瑞森團隊，出場時便戴上婚戒，讓凱薩琳為之震驚，並在後來凱撒琳向他解釋她對他有好感，他結婚了讓凱薩琳有夢想幻滅的惆悵。
• 尼克·史多克斯（Nick Stokes）：隨和友善的前兄弟會成員，具有刑事審判學位，是一位毛髮與纖維分析師，來自德州達拉斯。在他9歲的時候，遭到一個臨時女保姆的性侵害。他在前四季是葛瑞森團隊的一員，在第五季中期轉到了韋羅斯的午班團隊，後期則在名導演昆汀·塔倫提諾所受邀執導的特輯「葬身」兩集中成為事件受害者，獲救後，也藉此讓CSI團隊在第六季中全部重返夜班。尼克的父親是法官，父子關係親密，平時以乳名稱呼（尼克的乳名是蹦裘）（Pancho），因為他除了對